豚鼠苯羥化酶 (PAH) ELISA 試劑盒

獲得idea的兩種途徑：

1. 自上而下：先閱讀大量科研論文，弄清目前的研究現(xiàn)狀和要解決的問題等；

2. 自下而上：自己先冥思苦想一段時間，有了自己的idea后再去查文獻。

但值得注意的是，別人沒做過的東西，也許不是因為別人沒想到，很可能是因為沒有意義或者沒有可能性。

獲得好idea的基礎前提包括：

首先在科研前必須彌補基礎知識，這是看懂文獻的基礎；其次廣泛閱讀文獻；然后學會閱讀文獻，讀懂文章。

拿到一篇研究性論文，先看標題，立即停住，問自己幾個問題：

（1）這文章是怎么做的（可參考材料方法）？會做哪些內(nèi)容來說明其標題？

（2）為什么要做這個？

（3）如文章是近半年內(nèi)發(fā)表的，該文章解決了什么問題？引出了什么問題（結合你看的綜述）？接下來仔細看摘要，看你的想法是否與別人吻合？

（4）看完實驗結果，再思考有什么地方不完善？有沒有深入或拓展到底？下面還有什么問題可做，關鍵是你自己要思考，去發(fā)現(xiàn)。長期作戰(zhàn)，持之以恒。

為何牛血清在細胞培養(yǎng)實驗中如此受寵

作為各類種屬的高質量血清供應商，一般客戶咨詢血清購買時，我們都會推薦牛血清。而我公司zui為熱銷的血清產(chǎn)品中莫過于胎牛血清了，那么為何牛血清在細胞培養(yǎng)實驗中如此受寵呢？據(jù)酶聯(lián)生物技術員分析，主要原因有這五個方面：

1. 提供結合蛋白：作用是攜帶重要地低分子量物質，在細胞代謝過程中起重要作用。

2. 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

3. 提供基本營養(yǎng)物質：氨基酸、維生等是細胞生長必須的物質。

4. 提供激素和各種生長因子。

5. 對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用。

針對第五個原因，我們來重點談談。有一些細胞，如內(nèi)皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止的消化作用。

我司技術員分析，這是因為已經(jīng)被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了的粘度可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用。

特別說明到了有多位老師提出問題：人血清一定要加熱滅活嗎？不然會怎樣？其實對于它的加熱滅活是應該根據(jù)情況而定的。

很多朋友在使用實驗者認為一定需要加熱滅活，其實這個認知是不正確的，是否需要滅活是要根據(jù)情況而定。人們通常通過在56℃加熱30分鐘的辦法，來滅活其中的補體，以及其中可能的微生物（比如支原體）的污染。

加熱滅活帶來的問題是，其中的氨基酸、維生素和生長因子等也會不同程度的被破壞。

但是它的補體含量很低，即使在未稀釋的胎牛血清中，也觀察不到溶血現(xiàn)象。另外37℃的加熱能夠有效滅活補體。所以對它而言，并不需要通過專門的熱滅活來滅活其中的補體。

早期的人血清制備中的濾膜的孔徑大于0.22um，不能有效的去除支原體的污染。熱滅活可以去除支原體的污染。但是現(xiàn)在制備中的終端濾膜的孔徑為0.1um甚至小到0.04um，所以一般沒有支原體的污染。

通過以上，我們公司總結：除非有特別的情況，標準廠家生產(chǎn)的一般不需要加熱滅活。不過因考慮到其質量問題，為安全起見，還是以加熱滅活為好。

ELISA試劑盒的那點兒事

酶聯(lián)免疫吸附測定，又稱酶聯(lián)免疫吸附試驗，即ELISA，是酶免疫測定技術中應用的技術。1971年Engvall等人發(fā)表了使用ELISA定量測定IgG的文章，將1966年用于抗原定位的酶標抗體技術發(fā)展成液體標本中微量物質的測定方法。

ELISA的原理

ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上，利用抗原抗體特異性結合，檢測過程中，通常使用洗板的方式去除非結合物，最終酶促反應后的底物的顏色，對樣本中蛋白進行定性與定量。

不按說明書操作會造成的后果

每一個試劑盒里都會有對應的說明書，注意事項里大多都會提到“實驗嚴格按照說明書的操作進行"。為什么要嚴格按照說明書操作？為了更完整的回答這個問題，需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。

根據(jù)試劑的來源和標本的性狀及檢測的具體條件，可設計出不同類型的檢測方法。大致分為以下幾類：

1.雙抗體夾心法測抗原

2.雙抗原夾心法測抗體

3.競爭法測抗原

4.間接法測抗體

總結如果不按說明書操作可能會出現(xiàn)的不滿意結果。

A. 先說最嚴重的操作錯誤，看錯或壓根不看試劑盒配套說明書，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當作雙抗體夾心法來做，導致的結果就是整板顯示很強的藍色，無任何梯度。

B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導致的結果是，浪費珍貴的樣本，樣品的回收率達不到預期值，如果混用不同試劑盒的酶復合物，會導致顯色過弱或過強，因為每種試劑盒所用酶復合物效價可能不一樣。

C. 不看文獻或者不做預實驗。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻報道推算樣本應該1:10稀釋，結果稀釋成1:1000，導致的結果是顯色過弱，結果不可用。

D. 不校準移液器及培養(yǎng)箱的溫度濕度。導致工作試劑濃度不準確，孵育溫度不合適，實驗帶來誤差。

E. 洗滌不充分，每孔洗液加樣過少，或者殘留。導致的結果是顯色過快，同時背景較高。

F. 手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液，導致洗液污染，整個實驗失敗。

G. 剩余酶標板條未及時放入干燥袋，導致酶標板受潮，下一次再做時，顯色過弱或污染，CV值過高。

  ELISA常見主要試劑

1. 抗體：單抗特異性強，多抗結合性高，試劑盒需要高效的配對。

2. 2.抗原：大多為重組蛋白,細胞因子和待測樣本，高效標準品需NIBSC/WHO校準。

3. 3.顯色作用體系：首先辣根過氧化物酶（HRP）與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系，再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對-硝基苯磷酸酯可形成黃色底物，還有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高強度熒光。

ELISA的類型

根據(jù)試劑的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法，按照原理及操作，市面的方法有：

  1.間接法ELISA

是檢測抗體的方法，原理為利用酶標記的二抗以檢測已與固相結合的受檢抗體，顯色測定。優(yōu)勢在于待測一抗無需標記快速便捷。直接法ELISA與間接法ELISA相似，區(qū)別在于一抗酶標，檢測孵育也以抗原為主，但直接法ELISA的靈敏度有限，需權衡使用。

2.夾心法ELISA

又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法ELISA，原理相似，用于檢測抗體或抗原含量。以雙抗體夾心法為例，捕獲抗體包被在固相載體上，加入抗原或待測樣本結合，后加入的檢測抗體結合在抗原上，形成三明治夾心形式。雙抗夾心法是市面最常見與方便分析的方法。

3.競爭法ELISA

小分子抗原與半抗原的檢測方法常用競爭法ELISA，待檢樣本中抗原越多，被結合的酶標抗原的量會減少，彼此形成競爭負相關體系，顯色物質也就越少，根據(jù)顯色物質的比例可擬合得到待測抗原含量。

4.其他方法

a.免疫抑制法測ELISA：固相包被抗原，被檢樣本對底物顯色的抑制程度與樣本中所含抗原的量成正比，二者之差為待測抗原含量，原理類似與競爭法ELISA。

b.阻斷ELISA：目的檢測特異性抗體，也稱為競爭ELISA，原理為固相包被抗原，待測樣本與一抗酶標競爭孵育，待檢樣本中抗體越多，顯色越淺，反則反之。非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒中涉及該法。

c.此外有用于檢測IgM抗體的抗體捕捉ELISA，有固相載體改變的Dot-ELISA（硝酸纖維素膜）和C-ELISA（滌綸布），還有技術分類的TRFIA和多因子檢測等。

ELISA的評估

ELISA Kit的多指標決定了產(chǎn)品質量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項指標進行測定評估，分析如下：

  1、準確性

ELISA Kit的多指標決定了產(chǎn)品質量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對如下6大項指標進行測定評估，分析如下：

a.回收率：測定試劑盒對數(shù)據(jù)真實性的校準，過高或偏低會產(chǎn)生加樣和假性性的失準數(shù)據(jù)。

b.線性：測定試劑盒稀釋液與樣本微環(huán)境的的準確性，過高或偏低均會出現(xiàn)測定的偏差。

  2、精確度

a.板內(nèi)精確度：評價單次實驗中，同一個已知濃度不同復孔的差異。

b.板間精確度：評價同一樣本，多次實驗的差異。

 3、精密度

檢測限：能顯著區(qū)分空白信號的最小信號值對應的濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。

  4、特異性

a.交叉反應：評判特異性，不同分子與試劑盒抗體結合能力，交叉反應越大，特異性越差。

b.抗干擾能力：同源物的干擾，內(nèi)源性物質對檢測系統(tǒng)的干擾。

  5.天然樣本檢測性

對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結果。

  6、穩(wěn)定性

試劑盒時效性和穩(wěn)定性是對指標檢測的重要保障。穩(wěn)定性越高，試劑盒存儲時間越久。

ELISA的應用

ELISA技術是特定靶標蛋白質定量的金標準，提供快速，穩(wěn)定且易于分析的結果。可以對生物大分子/小分子的定量，對親和力測定評價或者篩選，還可對重組蛋白或細胞因子進行活性比對分析等運用。常應用于細胞因子，趨化因子，生長因子等檢測，同時應用于癌癥、干細胞、免疫學、神經(jīng)學和信號轉導等研究領域的靶標。

ELISA實驗所用試劑-酶的底物與最后步驟詳解介紹！

1，酶的底物

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HRP的底物

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HRP催化過氧化物的氧化反應，代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O

　　上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

　OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。

　　TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。

ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

　　另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于ELISA的優(yōu)點為可加寬定量測定的線性范圍。

　　HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。

豚鼠苯羥化酶 (PAH) ELISA 試劑盒

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AP的底物

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　　AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。

2，洗滌液

　　在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

3，　酶反應終止液

　　常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

4，陽性對照品和陰性對照品

　　陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質。

例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質，其中加入一定量的待檢物質，此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可對標本中受檢物質的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

5，參考標準品

　　定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。